Datenanalyse
2D-Gel Quantifizierung
3D-Teilansicht eines 2D-Gels mit überlappenden Spots unterschiedlicher Spotvolumina.
(Mit freundlicher Genehmigung von Dr. Irrgang, Max-Volmer-Institut, Technische Universität Berlin)
Korrekte Spottrennung und Quantifizierung sind eine Herausforderung für Spoterkennungsalgorithmen und das manuelle Spotediting.
Genaue Spotquantifizierung basiert auf einer korrekten Spoterkennung und beide Prozeduren sind zusammengenommen die Voraussetzung dafür, ein qualitativ hochwertiges Matching und letztendlich eine aussagekräftige Statistik bei der Analyse selektiver Proteinveränderungen zu erhalten.
Obwohl während der vergangenen Jahre eine beträchtliche Anzahl an 2D-Gel-Auswertesoftware-Lösungen unterschiedlicher Hersteller vorgestellt worden sind, die das Problem der Spotdetektion und Spotquantifizierung unterstützen, gibt es doch keine Software, die die Aufgabe wirklich fehlerfrei lösen kann. Typischerweise werden bei der Spotdetektion Fehlerraten von 2-10% erreicht. Die individuelle Qualität des Gels, die Färbemethode, das verwendete Software-Paket sowie die Erfahrung des Anwenders sind die Haupteinflussgrößen die bestimmen ob die Spotdetektionsfehler im Bereich um 2% oder eher bei 5-10% liegen.
Spotdetektionsfehler tragen zu falschen Gruppenzuordnungen während des Matchings einer 2D-Geldatenbank bei. Die Fehlzuordnungen entstehen dabei entweder durch die Bildung zusätzlicher Spotgruppen oder durch Fehlzuordnung/Ausschluss von Spots die nicht/bzw. doch zur entsprechenden Gruppe gehören. Diese Fehlzuordnungen bewirken oft erhebliche Fehler bei der Bestimmung des Mittelwerts der betroffenen Spotgruppen.
Während die Zuordnung der Spots zu Gruppen ggfs. noch manuell korrigiert werden kann, hängt die Richtigkeit der Spotquantifizierung, die erreicht werden kann, sowohl vom verwendeten Spotdetektionsalgorithmus, hauptsächlich aber von der Art und Qualität des verwendeten Proteinstainings ab.
Die Silberfärbung welche häufig für die Detektion schwächerer Proteinspots verwendet wird, bietet gute Empfindlichkeit (<1 ng Protein/Spot), hat jedoch einen vergleichsweise kleinen linearen dynamischen Bereich - lediglich etwas mehr als eine Größenordnung.
Coomassie R-250 Färbung, die am weitesten verbreitete Färbemethode, hat einen höheren linearen dynamischen Bereich, ungefähr 2 Größenordnungen, jedoch eine wesentlich schlechtere Empfindlichkeit (~200 ng Protein/Spot).
Coomassie G-250 Färbung, die häufig wegen ihrer höheren Empfindlichkeit (~25 ng Protein/Spot) und ihrer immer noch ausreichenden Kompatibilität mit massenspektrometrischer Proteinidentifizierung eingesetzt wird, liefert hier bessere Ergebnisse, auch wenn diese nicht ganz die bei anderen Färbemethoden darstellbaren Spotzahlen erreicht.
Fluorescence-Färbung wurde mit der Einführung von SYPRO®-Ruby die erste Wahl als Färbemethode für die auf 2D-Gelen basierende Expressionsanalyse von Proteinen. Sypro® Ruby Färbung bietet sowohl sehr gute Empfindlichkeit (~1 ng Protein/Spot) als auch einen linearen dynamischen Quantifizierungsbereich von ~ 3 Größenordnungen. Diese Eigenschaften können heute als die Minimalanforderung für die Durchführung quantitativer Proteomestudien angesehen werden.
Eine beträchtliche Auswahl anderer Fluoreszenzfarbstoffe stehen inzwischen für die Proteinfärbung zur Verfügung. Einige der Stains gehören zur SYPRO®-Produktreihe, einige verwenden den SYPRO®-Ruby -Farbstoff in einer vom Original abweichenden Formulierung, andere sind Neuentwicklungen, wie der Deep PurpleTM-Stain. Unserer Erfahrung nach weist keiner dieser Fluoreszenzstains eine gegenüber dem Original konsistent verbesserte Performance auf. Die Nachteile "alternativer" Fluoreszenzstains liegen entweder in verminderter Empfindlichkeit, aufwendigeren Färbeprozeduren oder inkonsitenter, pH-abhängiger Sensitivität. Alle Fluoreszensstains, die ein hohes Qualitätsniveau bei der Proteindetektion erreichen tragen nicht unwesentlich zu den Gesamtkosten des 2D-Gelprozesses bei.
Die Methodik der Radio-Markierung vereint höchste Empfindlichkeit (<0.1 ng/spot) mit dem höchsten linearen dynamischen Quantifizierungsbereich (4-5 Größenordnungen), ist aber andererseits wesentlich aufwändiger, da einerseits die Sicherheit des Personals während der Handhabung der Gele gewährleistet werden muss, und zusätzliche Umweltschutz- und Entsorgungsvorschriften zu beachten sind.
Die Wahl einer problemangepassten Proteinfärbemethodik ist sehr wesentlich für die letztendlich erzielbare Qualität einer 2D-Gel-Proteome-Datenbank, da sie durch ihre hohe (oder fehlende) Qualität, die Güte der Spotdetektion und damit die Genauigkeit des Spotmodels, die Güte des Matchings und vermittelt durch diese Einflussgrößen letztendlich die statistische Validität einer 2D-Gel-Proteome-Datenbank bestimmt. So muss unabhängig von der ursprünglich durch die Software erzielten Spotdetektionsqualität, der Anteil der fehldetektierten Spots eines Matchsets in der Regel deutlich unter 1% liegen um eine ausreichende Qualität der Auswertung zu gewährleisten. Manuelle Korrektur fehldetektierter Spots durch einen erfahrenen 2D-Gel-Software-Anwender trägt hierbei wesentlich zur Verbesserung der Qualität von Spotdetektion und Spotmatching bei und steigert in der Folge die Validität aller während der statistischen Auswertung erzielbaren Ergebnisse.
SYPRO® ist ein eingetragenes Warenzeichen von Molecular Probes Inc., Eugene (USA)
Deep PurpleTM ist ein Warenzeichen von Amersham Biosciences AB, Uppsala (Schweden)
