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Datenanalyse

Mascot-Suche


Ergebnis einer Mascot-Suche für eine MALDI-MS Massenliste.
Die Probe wurde aus einem hochauflösenden 2D-NEPHGE-Gel gewonnen. Probe: Synechocystis sp. 6803 Thylakoide. Das identifizierte Protein ist Ferredoxin, ein Redoxprotein, das Elektronen vom Photosystem I empfängt. Es liegt am Ende der photosynthetischen Elektronentransferkette, auf der cytoplasmatischen Seite der Thylakoidmembran.
(Mit freundlicher Genehmigung von Dr. Irrgang, Max-Volmer-Institut, Technische Universität Berlin)


MALDI-MS-Fingerprints

Ein MALDI-MS-Gerät das hohe Massengenauigkeit und Auflösung, einen hohen Durchsatz und eine geeignete Auswahl an Targets für unterschiedliche Probenmengen zur Verfügung stellt ist zusammen mit der Verfüg- barkeit der gesamten genetischen Information für die zu untersuchende Spezies die Hauptvoraussetzung für erfolgreiche Proteinidentifizierungen durch MALDI-MS-Fingerprints. Wenn diese Voraussetzungen erfüllt sind und die Spektren sorgfältig ausgewertet werden können die Proteine, die nicht oder nur mäßig posttrans- lational modifiziert sind, leicht mit Hilfe dieser Technik identifiziert werden.
Die erste verbleibende analytische Herausforderung ist es für jedes individuelle Signal der Massenliste tatsächlich eine möglichst hohe Massengenauigkeit zu gewährleisten. <200 ppm können durch externe Kalibrierung, <10 ppm können durch interne Kalibrierung erreicht werden. In beiden Fällen hängt die Genauigkeit der das Protein identifizierenden Massensignale zu einem gewissen Grad von der Anzahl und der m/z-Verteilung der Kalibriermassen ab.
Die Festlegung einer geeigneten Signal/Rauschschwelle, die einen guten Kompromiss zwischen dem Verlust schwacher Probensignale und dem Ausschluss möglichst vieler Artefakt-Signale liefert, sowie der konsequente Ausschluss aller bekannten Artefakte von der Massenliste bevor diese für die Mascot-Suche verwendet wird, sind weitere Schritte auf dem Weg zur erfolgreichen Identifizierung.
Wiederholte Datenbanksuchen unter Berücksichtigung der Proteinmodifikationen, die die Probe aufgrund Ihrer experimentellen Historie in der Zeitspanne zwischen Transkription und Auftreffen auf dem Detektor des Massenspektrometers wahrscheinlich erlitten hat, sind ein weiterer Faktor, der die Wahrscheinlichkeit einer Proteinidentifizierung aus MALDI-MS-Fingerprint-Spektren erhöht.


ESI-MS-Daten

Der Erfolg einer Mascot-Suche für ESI-MS Sequenzdaten hängt von der Länge bzw. Spezifität (Einmaligkeit) der erhaltenen Sequenzen ab. Die Menge an verfügbarer Probe bestimmt die Länge der Messzeit, d.h. wieviele Fragmente im MS/MS-Mode untersucht werden können. Eine große Zahl von MS/MS-Untersuchungen verbessert die Wahrscheinlichkeit spezifische Sequenzen zu erhalten. Da Messzeit (d.h. die Probenmenge) gewöhnlich ein limitierender Faktor ist, wird eine gut optimierte Strategie zur Auswahl der am meisten versprechenden Ionen für die MS/MS-Untersuchungen benötigt.
Sorgfältiger Ausschluss von Signalen, die bekanntermaßen autolytische Fragmente der für die Spaltung benutzten Protease oder andere Artefaktsignale darstellen mit Hilfe von Ausschlusslisten, erhöhen auch hier wesentlich die Wahrscheinlichkeit spezifische Information zu erhalten, auch wenn nicht alle Artefaktsignale aufgrund von unspezifischen Spaltungen (Insource-Decay-Fragmente) von vornherein als solche erkannt werden können.
Die jetzt noch verbleibende Nicht-Spezifität der Sequenzen hängt direkt von biologischen Eigenschaften ab und liegt in dem Umstand, dass manche Proteine Sequenzabschnitte wie z.B. poly-A-Sequenzen oder häufig beobachtete Kofaktor-Bindungsmotive enthalten. Die Identifizierung von Sequenzen dieser Art ist, obwohl prinzipiell nützlich für die Klassifizierung des Proteins, nur von sehr begrenztem Wert für die Mascot-Suche, da nicht zwischen den verschiedenen Proteinen der jeweiligen Klasse unterschieden werden kann.

Die von Mascot ebenfalls unterstützte MS/MS-Ionen-Suche unter Verwendung der aus Fragmentierungs- spektren gewonnenen Massenlisten stellt eine alternative und bequeme Methodik der Proteinidentifizierung dar, die zudem häufig hohe Mowse Scores liefert, erfordert aber wie die MALDI-MS-Fingerprint-Methode das Vorhandensein der kompletten genetischen Information des untersuchten Organismus. Ansonsten unterliegt diese Methode den gleichen Einschränkungen wie vorstehend für die denovo-Sequenzierung beschrieben.